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組胺是一種含氮的有機化合物,是由組氨酸在脫羧酶的作用下產(chǎn)生的。一般存在于皮膚、肺部和腸粘膜的肥大細胞中,當發(fā)生炎癥的時候,就會釋放出組胺來了。組胺會讓血管舒張,增加毛細血管和微靜脈的管壁通透性,血漿進入到組織中就會導(dǎo)致局部水腫。組胺的化學(xué)式為C5H9N3,分子量111.145,由咪唑環(huán)(含氮雜環(huán))與乙胺基團通過兩個碳原子連接構(gòu)成。組胺易溶于水,可溶于乙醇,微溶于乙醚,氯仿等。在日光下容易變質(zhì),需避光保存。
檢測組胺含量的方法,實驗室常用到高效液相色譜(HPLC)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、比色法等。以HPLC為例,簡單的介紹一下過程。技術(shù)參數(shù)比較粗略,如果要詳細的操作步驟和參數(shù),可咨詢或參考相關(guān)的文獻資料。
1.樣品前處理
使用0.4mol/L的高氯酸溶液提取樣品中的組胺,提取出來還要用10mg/mL的丹磺酰氯溶液進行衍生化處理,便于后續(xù)的HPLC測定。衍生化處理,是為了提高檢測靈敏度。
2.色譜條件
C18色譜柱,250mm長,4.6mm內(nèi)徑,5um粒徑;常用的流動相為甲醇和乙酸銨,流速為1ml/min,紫外檢測器,波長254nm,進樣量10-20uL。
3.標準曲線
用組胺的標準品配制出標準溶液母液,比如1mg/mL,梯度稀釋6個濃度點并記錄下來。衍生化處理后,進樣到HPLC測各個濃度的色譜峰。由于標品是相對純的,測出來的色譜峰要符合要求,在前期方法開發(fā)的時候就要先調(diào)整好各個參數(shù),避免出現(xiàn)錯誤或浪費現(xiàn)象。對各個濃度點測出來的色譜峰,記錄它們的保留時間,并對它們的峰面積分別進行積分處理,對應(yīng)它的濃度,在表格中可以擬合出標準曲線,得到回歸方程。
4.樣品測定
樣品的測定過程是相似的,根據(jù)保留時間,找到色譜峰,并對色譜峰面積進行積分,代入到回歸方程,計算出樣品溶液中的組胺含量。