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β谷甾醇是一種天然的植物甾醇,它廣泛的存在于水果、蔬菜、堅果、種子、大豆油和棉籽油等中。它的化學式C30H52O,分子量414.707,易溶于氯仿、二硫化碳,微溶于乙醇、丙酮,不溶于水,被用于醫(yī)藥原料、食品、化妝品等工業(yè)領域。從科研方面來說,它具有調節(jié)膽固醇水平,免疫調節(jié),抗炎,抗氧化和細胞保護等作用。
檢測樣本中的β-谷甾醇含量,常用的方法是高效液相色譜(HPLC),氣相色譜(GC),也有用到氣相色譜質譜聯(lián)用(GC-MS)的。氣相色譜測的話,需先衍生化(如硅烷化)生成揮發(fā)性衍生物,通過氣相色譜柱分離,氫火焰離子化檢測器(FID)或質譜檢測器(MS)定量。以HPLC為例,簡單的介紹一下檢測流程。
1.樣品處理
植物樣品一般用正己烷或石油醚提取脂質,用KOH乙醇溶液皂化水解脂肪酸,用正己烷萃取游離甾醇。濃縮萃取液,0.45um膜過濾,待測。
2.色譜條件
采用C18反相色譜柱,250mm長,4.6mm內徑,5um粒徑,柱溫30-40℃或設置35℃。以甲醇和水為流動相(95:5),等度洗脫。紫外檢測器,波長為205nm或210nm,進樣量10uL。僅供參考。
3.標準曲線
用β谷甾醇的標準品用甲醇進行溶解并定容到一定的濃度,稱為β谷甾醇的標準母液。梯度稀釋5-7個濃度點,這個稀釋的倍數(shù)可以是2,5,10等,盡可能的覆蓋到樣本溶液的濃度范圍,這里需要考慮的是hplc的檢測限。將各個濃度標準品進樣到HPLC中,對各個色譜峰的面積進行積分,擬合標準曲線,得到回歸方程。
4.樣品測定
根據(jù)保留時間,可以對樣品的色譜峰確定β谷甾醇的峰。對這個峰面積進行積分,并代入到回歸方程,計算出樣品溶液中的β谷甾醇的含量。